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團聚細胞計數(shù)的應(yīng)用解決方案:Cell Type參數(shù)優(yōu)化

點擊次數(shù):488 更新時間:2024-07-26

前言

團聚細胞計數(shù)的應(yīng)用解決方案:Cell Type參數(shù)優(yōu)化



Vi-CELL BLU細胞計數(shù)和活率分析儀最少僅需170uL樣品體積即可得到細胞密度和活率結(jié)果。為了準確分析不同細胞,Vi-CELL BLU提供了創(chuàng)建和優(yōu)化自定義Cell Type設(shè)置的功能。本文我們拿容易團聚的HEK293細胞給大家介紹下Cell Type的設(shè)置是如何影響樣品的處理和圖像分析。

在分析團聚細胞時,Cell Type設(shè)置中首先會使用到的參數(shù)是Decluster degree,我們可以設(shè)置為None,Low,Medium或High,并且使用更靠后的值會增加軟件對團聚細胞的識別能力。

當出現(xiàn)過多的團聚,我們還需要考慮增加對樣品的Aspiration和Mixing Cycles次數(shù)。在每次Aspiration過程中,細胞樣品會在樣品管和注射器之間來回吹打混懸。對于那些很難混懸分散或傾向于粘到樣品杯壁上的細胞樣品,建議使用這種方法。在Mixing Cycle過程中,臺盼藍和細胞樣品一起在樣品管和注射器之間來回混勻。增加Mixing Cycles次數(shù)會讓臺盼藍混勻地更好。Vi-CELL BLU細胞計數(shù)和活率分析儀的設(shè)計降低了剪切力對細胞的傷害。另外,低剪切力可以提高結(jié)果的重現(xiàn)性。但增加Aspiration或Mixing Cycles會提高額外剪切力,從而對比較脆弱的細胞產(chǎn)生潛在的危害。但是,對于團聚細胞系,這些額外的剪切力則可以用于破壞細胞的團聚。

Decluster degree和Aspiration/Mixing Cycles之間重要的區(qū)別在于它們是在哪個時刻影響的分析結(jié)果。Decluster degree只對測試結(jié)束后保存在軟件上的細胞照片根據(jù)不同設(shè)置的Decuster degree重新進行分析。而Aspiration和Mixing Cycles是在拍照前對細胞樣品就產(chǎn)生了影響,測試結(jié)束后無法再修改Aspiration和Mixing Cycles數(shù)值,得到再分析的結(jié)果。

團聚細胞計數(shù)的應(yīng)用解決方案:Cell Type參數(shù)優(yōu)化

因此,優(yōu)化Cell Type對于得到好的結(jié)果很重要,本文中對于團聚細胞分析,如何調(diào)整Cell Type提供了一些指導(dǎo)。

團聚的細胞懸液也是細胞培養(yǎng)條件欠佳的指標,包括但不限于過度消化、環(huán)境應(yīng)激、過度生長和污染。細胞團聚限制了細胞對資源和可用增殖空間的獲取。這將阻礙細胞生長,降低通量,并影響下游分析結(jié)果,譬如像流式細胞儀分析方法需要單細胞溶液。此外,ISO 20391-1(4)中聲明,為了獲得最佳計數(shù)結(jié)果(與所使用的分析方法無關(guān)),需要單細胞懸浮液,并且需要正確的樣品制備流程。Vi-CELL BLU 細胞計數(shù)和活率分析儀用紅色框標記(非常)大的細胞團。由于對大細胞團進行計數(shù)容易出錯,因此這些大細胞團不會進行去團聚處理,并會自動從計數(shù)中排除。這些大細胞團的數(shù)量可以在結(jié)果文件的“Cluster Count"中找到,這是培養(yǎng)物中細胞團聚的良好指標。如果觀察到細胞團較多時,建議進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件或進行樣品處理。


方法


這些實驗中使用的是FreeStyle 293-F 細胞(Thermo Fisher,Cat.編號:R79007)。將 HEK 懸浮細胞在含有FreeStyle 293(30 mL)表達培養(yǎng)基的 50 mL Falcon 管中培養(yǎng),每 3-4 天傳代培養(yǎng)一次,接種細胞密度為 0.2x106 個細胞/mL。它們在 37°C、250 rpm 和 5% CO2 濃度下孵育。

使用培養(yǎng) 4 天的細胞樣品進行初始測量,在Normal模式下使用Mammalian Cell Type重復(fù)測量 5 次。然后結(jié)果被導(dǎo)出(每 10 張圖像照片保存一張)并離線重新分析。為了重新分析,基于默認的Mammalian Cell Type創(chuàng)建了另外兩個Cell Type,但將去團聚度設(shè)置為Low和High。為了研究不同去團聚度設(shè)置的有效性,比較了這三種Cell Type總細胞密度和活細胞密度以及活率的結(jié)果。

之后,開始用 HEK 293-F 細胞進行新鮮培養(yǎng),并在第 0、1、2、3 和 6 天取樣。然后,測試了其他采樣參數(shù),因為所有日期的樣品都用默認的Mammalian Cell Type,以及將Aspiration和Mixing Cycles增加到10次的Cell Type。在所有采樣日,將細胞培養(yǎng)液用 5 mL 移液器混合 2 次,然后將 5 mL 細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到 15 mL  Facon管中。接著,用 1000 μL 移液器將樣品再混合 3 次,再將 3 x 500 μL 細胞樣品轉(zhuǎn)移到 Vi-CELL XR 細胞計數(shù)和活率分析儀樣品管中,以及將 6 x 200 μL 細胞樣品轉(zhuǎn)移到 Vi-CELL BLU 96 孔板中。Vi-CELL XR 細胞計數(shù)和活率分析儀上的樣品,使用圖 1 所示的Cell Type分析;在Vi-CELL BLU細胞計數(shù)和活率分析儀上,兩種Cell Type交替進行。然后,將 2 x 10 μL 細胞樣品與臺盼藍 1:1 混合并轉(zhuǎn)移到一次性血球計數(shù)板中手動計數(shù)。


團聚細胞計數(shù)的應(yīng)用解決方案:Cell Type參數(shù)優(yōu)化

圖1:Vi-CELL XR上的分析設(shè)置,選擇的設(shè)置類似于Vi-CELL BLU上的設(shè)置


然后,在Vi-CELL BLU細胞計數(shù)和活率分析儀上運行的樣品以High Decluster degree重新分析,在 Vi-CELL BLU 細胞計數(shù)和活率分析儀上共生成4種不同的細胞計數(shù)結(jié)果,以與 Vi-CELL XR細胞計數(shù)和活率分析儀的結(jié)果和手動計數(shù)結(jié)果進行比較。


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表1. Vi-CELL BLU分析HEK 293-F的Cell Type,Mammalian Cell Type作為其他3個Cell Types的模板。




結(jié)果

在三個Decluster degree下(Low,Normal和High)得到的平均總細胞密度和活細胞密度(分別為 TCD 和 VCD)和活率進行了比較(圖2)。更高的去團聚度使得TCD 和 VCD 值均明顯增加(R2 > 0.98)。然而,使用較低或較高的Decluster degree時,細胞活率卻并不顯著增加或減少。


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圖2:Vi-CELL BLU使用不同Decluster degree設(shè)置分析HEK 293-F的結(jié)果。平均總細胞和活細胞密度顯示在左軸上,平均活率顯示在右軸上。誤差線表示標準差。


表 2 中的圖像顯示了Decluster degree如何影響樣品分析,從而影響細胞濃度結(jié)果。所選圖像是圖2中其中一個測量樣品的圖像(部分),并且很好地表示了細胞樣品的狀態(tài)。如前所述,HEK 293 F細胞傾向于形成團聚體,而這些團聚體中的細胞可能難以計數(shù)準確。當 Decluster degree 設(shè)置為 low 時,某些團聚將不再被解聚,并且標有藍色圓圈,表示Vi-CELL軟件錯誤地將它們識別為單個顆粒,因為其尺寸較大,根據(jù)所選Cell Type參數(shù)未歸為一個細胞。通過更高的去團聚度,可以分析更多這些團聚細胞,從而產(chǎn)生單個團聚標記為Normal Decluster degree,所有團聚細胞均在High declustering下進行分析。更高的Decluster degree設(shè)置會導(dǎo)致識別出額外的細胞,可能導(dǎo)致人為地提高細胞密度,因為單個細胞可能(幾乎)分裂成兩個或多個顆粒。這些顆粒是被忽略還是算作活細胞或死細胞取決于其他Cell Type參數(shù),例如大小、圓度和亮度。因此,優(yōu)化Cell Type設(shè)置對于獲得準確的結(jié)果很重要。


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表2. 不同Decluster degree設(shè)置的分析結(jié)果,隨著Declustering增加,更多的細胞團聚被分析,細胞團聚體中更多的細胞被識別。


請注意,Cluster count不受Decluster degree的影響。對于“Low"和“High"設(shè)置,每次測量平均計數(shù) 1.6 個Clusters。Cluster count指示在樣本中發(fā)現(xiàn)了多少個過大的細胞團聚體。這些Cluster用紅色框標記,并且無論Decluster degree如何,都全部排除在分析之外。因此,高的Cluster count是大細胞團聚體的良好指示,需要在培養(yǎng)處理或樣品制備方面進行額外優(yōu)化,以獲得準確的細胞計數(shù)結(jié)果。

最終,在優(yōu)化Cell Type設(shè)置時,Vi-CELL BLU 軟件還提供了增加Aspiration和Mixing cycles的可能性。增加Aspiration和Mixing的影響評估,是使用默認的Mammalian Cell Type,將其中的Aspiration和Mixing cycles都設(shè)為10,每天對 HEK 293-F 細胞樣品進行采樣,并一式三份測定細胞密度。之后,使用表1所述的High Decluster degree重新分析所有測量值。將結(jié)果與使用Vi-CELL XR細胞計數(shù)和活率分析儀及手動計數(shù)獲得的值進行比較(圖3)。


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圖3: Vi-CELL BLU用4種不同Cell Types檢測的總細胞密度和活率(藍-灰色),Vi-CELL XR(紅色)和手動細胞計數(shù)(綠色)。誤差線表示標準差。


圖 3 顯示了 Vi-CELL XR細胞計數(shù)和活率分析儀、血球計數(shù)板、Vi-CELL BLU 細胞計數(shù)和活率分析儀(使用默認Mammalian Cell Type)測試6天得到的細胞密度和活率具有可比性。此外,Mixing增加和/或High declustering的Cell Type會導(dǎo)致更高的細胞密度。在第3天,測量的平均 TCD 介于 2.81 – 4.12 百萬個細胞/mL 之間,分別使用默認的 Mammalian 和 Mammalian A10M10  High decluster。因此,與默認設(shè)置相比,更改兩個參數(shù)后結(jié)果增加了 47%。

然而,在第6天存活率下降到~70%,而且手動計數(shù)的TCD明顯比自動細胞計數(shù)儀的TCD更高。表 3 中的圖像(通過顯微鏡顯示 Neubauer 分析室)為這種偏差提供了清晰地解釋,因為與第 3 天相比,第 6 天的細胞樣品中顯示有更多的細胞聚集體。這些細胞聚集體很難計數(shù),在分析過程中大的團聚細胞將被全部忽略。


團聚細胞計數(shù)的應(yīng)用解決方案:Cell Type參數(shù)優(yōu)化

表3: 第3和第6天HEK 293-F細胞計數(shù)顯微鏡下的照片。第6天可以看到更多的細胞團聚體,細胞活率降低。


專注于培養(yǎng)的前 3 天(圖 4)可以進一步研究不同的Cell Type設(shè)置如何影響計數(shù)結(jié)果。第 3 天血球計數(shù)板圖像(表 3)顯示,到目前為止,細胞主要以小聚集體或單細胞形式生長。仔細觀察Cluster count可以發(fā)現(xiàn),Clusters的平均數(shù)量從第 1 天的 0.7 個增加到第 2 天的 3.7 個和第 3 天的 8.7 個。同時,更高的Mixing和Aspiration cycles的效果似乎有所增加,第 1 天的 TCD 增加了 4%,而第 2 天和第 3 天分別增加了 17% 和 25%。在Mammalian A10M10 High decluster設(shè)置下的結(jié)果一直是最高濃度。


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圖4: HEK培養(yǎng)的前3天。在 Vi-CELL BLU 上以藍灰色以及 Vi-CELL XR(紅色)和手動計數(shù)(綠色)測定四種不同的細胞密度和活率。誤差線表示標準差。


總之,每日采樣結(jié)果進一步證明了正確Cell Type設(shè)置的重要性。僅改變?nèi)齻€參數(shù)就導(dǎo)致 TCD 增加 47%。測量團聚的HEK細胞時,調(diào)整Decluster degree和Mixing/Aspiration cycles可以得到更高的TCD。然而,第6天的數(shù)據(jù)(圖3)表明,應(yīng)避免過度團聚的細胞樣品,因為與手動計數(shù)相比,所有Cell Type的結(jié)果都明顯較低。

討論

本文討論了使用 Vi-CELL BLU 細胞計數(shù)和活率分析儀優(yōu)化細胞計數(shù)結(jié)果的幾種選擇。除了優(yōu)化一般的培養(yǎng)處理 - 這將改善細胞健康、通量和產(chǎn)率 – 可以通過調(diào)整樣品處理和分析來改進。通過演示使用不同Cell Type設(shè)置的影響,可以清楚地看出針對所用細胞系和應(yīng)用優(yōu)化這些設(shè)置對于獲得好的分析結(jié)果至關(guān)重要。

在處理傾向于形成聚集體的細胞系時,對Decluster degree、Aspiration cycles和Mixing cycles的擬議更改是優(yōu)化計數(shù)性能的良好起點。但是,當可能需要進一步優(yōu)化時,請隨時向貝克曼庫爾特生命科學(xué)的相關(guān)技術(shù)人員尋求支持。





● 參考資料:

1. Cell Culture Problems: Cell Clumping – Causes, How to Unclump Cells & How to Avoid Cell Clumping. akadeum.co m. [Online] Akadeum Life Sciences, February 2021. [Cited: 25 July 2023.]

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3. Biomass and Aggregation Analysis of Human Embryonic Kidney 293 Suspension Cell Cultures by Particle Size Measurement. Yung-Shyeng Tsao, Russell G. G. Condon, Eugene J. Schaefer, David A. Lindsay, and Zhong Liu. s.l. : Biotechnology progress, 2000, Bd. 16(5). 809-814.

4. ISO 20391-1. Biotechnology — Cell counting — Part 1: General guidance on cell counting methods. s.l. : ISO/TC 276, Biotechnology, 2018-01. First edition. ISO 20391-1:2018(E). 5. Cluster Count Analysis and Sample Preparation Considerations for the Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer. Wu, Andrew. s.l. : Beckman Coulter Life Sciences, 2023. 2023-GBL-EN-101754.

5. Cluster Count Analysis and Sample Preparation Considerations for the Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer. Wu, Andrew. s.l. : Beckman Coulter Life Sciences, 2023. 2023-GBL-EN-101754.





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